Mbinu za utafiti wa baiolojia ya molekuli zina jukumu kubwa katika dawa za kisasa, uchunguzi wa kimaabara na baiolojia. Shukrani kwa maendeleo katika utafiti wa DNA na RNA, mtu anaweza kujifunza genome ya viumbe, kuamua wakala wa causative wa ugonjwa, kutambua asidi ya nucleic inayotaka katika mchanganyiko wa asidi, nk.
Mbinu za utafiti wa baiolojia ya molekuli. Ni nini?
Huko nyuma katika miaka ya 70 na 80, wanasayansi kwa mara ya kwanza walifaulu kufafanua jenomu la binadamu. Tukio hili lilitoa msukumo kwa maendeleo ya uhandisi jeni na biolojia ya molekuli. Utafiti wa sifa za DNA na RNA umesababisha ukweli kwamba sasa inawezekana kutumia asidi hizi za nucleic ili kugundua ugonjwa, soma jeni.
Kupata DNA na RNA
Njia za uchunguzi wa kibayolojia wa molekuli huhitaji kuwepo kwa nyenzo ya kuanzia: mara nyingi zaidi ni asidi nucleic. Kuna njia kadhaa za kutenganisha vitu hivi kutoka kwa seli za viumbe hai. Kila mmoja wao ana faida na hasara zake, na ni muhimuzingatia wakati wa kuchagua mbinu ya kutenga asidi tupu ya nukleiki.
1. Kupata DNA kulingana na Marmur. Njia hiyo inajumuisha kutibu mchanganyiko wa vitu na pombe, kama matokeo ya ambayo DNA safi hupanda. Ubaya wa njia hii ni matumizi ya vitu vikali: phenol na kloroform.
2. Kutengwa kwa DNA kulingana na Boom. Dutu kuu inayotumiwa hapa ni guanidine thiocyanate (GuSCN). Huchangia katika kunyesha kwa asidi ya deoxyribonucleic kwenye substrates maalumu, ambayo inaweza baadaye kukusanywa kwa kutumia bafa maalum. Hata hivyo, GuSCN ni kizuizi cha PTC, na hata sehemu ndogo yake inayoingia kwenye DNA iliyo na mvua inaweza kuathiri mwendo wa mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi, ambayo ina jukumu muhimu katika kufanya kazi na asidi nucleic.
3. Sedimentation ya uchafu. Njia hiyo inatofautiana na yale yaliyotangulia kwa kuwa sio molekuli ya asidi ya deoxyribonucleic ambayo hupunguzwa, lakini uchafu. Kwa kufanya hivyo, kubadilishana ion hutumiwa. Ubaya ni kwamba si vitu vyote vinaweza kunyesha.
4. Uchunguzi wa wingi. Njia hii hutumiwa katika hali ambapo taarifa halisi kuhusu utungaji wa molekuli ya DNA haihitajiki, lakini ni muhimu kupata data fulani ya takwimu. Hii inafafanuliwa na ukweli kwamba muundo wa asidi nucleic unaweza kuharibiwa wakati wa kutibiwa na sabuni, hasa alkali.
Uainishaji wa mbinu za utafiti
Mbinu zote za utafiti wa kibaolojia wa molekyuli zimegawanywa katika vikundi vitatu vikubwa:
1. Kukuza (kwa kutumia enzymes nyingi). Hapainarejelea PCR - mmenyuko wa msururu wa polimerasi, ambayo ina jukumu kubwa katika mbinu nyingi za uchunguzi.
2. Isiyo ya kukuza. Kundi hili la mbinu linahusiana moja kwa moja na uendeshaji wa mchanganyiko wa asidi ya nucleic. Mifano ni blots 3, mseto wa in situ, n.k.
3. Mbinu kulingana na utambuzi wa ishara kutoka kwa molekuli ya uchunguzi ambayo hufunga kwa uchunguzi maalum wa DNA au RNA. Mfano ni Mfumo wa Kukamata Mseto (hc2).
Enzymes zinazoweza kutumika katika mbinu za utafiti wa baiolojia ya molekuli
Njia nyingi za uchunguzi wa molekuli huhusisha matumizi ya anuwai ya vimeng'enya. Zifuatazo ndizo zinazotumika sana:
1. Kimeng'enya cha kizuizi - "hupunguza" molekuli ya DNA katika sehemu muhimu.
2. DNA polimasi - hutengeneza molekuli yenye nyuzi mbili ya asidi ya deoxyribonucleic.
3. Reverse transcriptase (revertase) - hutumika kuunganisha DNA kwenye kiolezo cha RNA.
4. DNA ligase - inayohusika na uundaji wa vifungo vya phosphodiester kati ya nyukleotidi.
5. Exonuclease - huondoa nyukleotidi kutoka sehemu za mwisho za molekuli ya deoxyribonucleic acid.
PCR ndiyo njia kuu ya ukuzaji wa DNA
Polymerase chain reaction (PCR) inatumika kikamilifu katika biolojia ya kisasa ya molekuli. Hii ni njia ambayo idadi kubwa ya nakala zinaweza kupatikana kutoka kwa molekuli moja ya DNA (molekuli hukuzwa).
Utendaji kuu wa PCR:
- uchunguzimagonjwa;
- uundaji wa sehemu za DNA, jeni.
Vipengele vifuatavyo vinahitajika ili kutekeleza mmenyuko wa polimerasi: molekuli ya awali ya DNA, polimasi ya DNA inayoweza joto (Taq au Pfu), deoxyribonucleotide phosphates (vyanzo vya besi za nitrojeni), vianzio (vipimo 2 kwa kila molekuli 1 ya DNA) na mfumo wa bafa wenyewe, ambamo miitikio yote inawezekana.
PCR ina hatua tatu: kubadilika, uwekaji wa kwanza na kurefusha.
1. Denaturation. Katika halijoto ya nyuzi joto 94-95 Selsiasi, vifungo vya hidrojeni kati ya nyuzi mbili za DNA huvunjika, na kwa sababu hiyo tunapata molekuli mbili zenye nyuzi moja.
2. Ufungaji wa primer. Katika halijoto ya nyuzi joto 50-60, vianzio huambatishwa kwenye ncha za molekuli za asidi ya nukleiki yenye ncha moja kwa aina ya ukamilishano.
3. Kurefusha. Katika halijoto ya nyuzi 72, usanisi wa molekuli za binti zenye ncha mbili za asidi ya deoksiribonucleic hutokea.
mfuatano wa DNA
Njia za utafiti wa kibiolojia ya molekuli mara nyingi huhitaji ujuzi wa mfuatano wa nyukleotidi katika molekuli ya asidi ya deoksiribonucleic. Mpangilio unafanywa ili kuamua kanuni za maumbile. Uchunguzi wa molekuli ya siku zijazo utatokana na ujuzi unaopatikana kutokana na mpangilio wa kibinadamu.
Aina zifuatazo za mpangilio zinatofautishwa:
- Mfuatano wa Maxam-Gilbert;
- Mfuatano wa sanger;
- pyrosequencing;
- nanoporempangilio.
